经过27年的长期努力，于明神宗万历六年（1578年）完成《本草纲目》初稿，时年61岁。以后又经过10年做了三次修改，前后共计40年。万历二十二年（公元1593年）去世。万历二十五年（1596年），也就是李时珍逝世后的第三年，《本草纲目》在金陵（今南京）正式刊行。
而据说，除了《本草纲目》之外，李时珍的著作尚有《奇经八脉考》、《濒湖脉学》传世；还有《命门考》、《濒湖医案》、《五脏图论》、《三焦客难》、《天傀论》、《白花蛇传》等，皆佚。
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李时珍借用朱熹的《通鉴纲目》之名，定书名为《本草纲目》。嘉靖三十一年（1552年），着手编写，至明万历六年（1578年）三易其稿始成，前后历时27年。
《本草纲目》凡16部、52卷，约190万字。全书收纳诸家本草所收药物1518种，在前人基础上增收药物374种，合1892种，其中植物1195种；共辑录古代药学家和民间单方11096则；书前附药物形态图1100余幅。这部伟大的著作，吸收了历代本草著作的精华，尽可能的纠正了以前的错误，补充了不足，并有很多重要发现和突破。是到16世纪为止中国最系统、最完整、最科学的一部医药学著作。
后人认为，李时珍打破了自《神农本草经》以来，沿袭了一千多年的上、中、下三品分类法，把药物分为水、火、土、金石、草、谷、莱、果、木、器服、虫、鳞、介、禽、兽、人共16部，包括60类。每药标正名为纲，纲之下列目，纲目清晰。书中还系统地记述了各种药物的知识。包括校正、释名、集解、正误、修治、气味、主治、发明、附录、附方等项，从药物的历史、形态到功能、方剂等，叙述甚详，丰富了本草学的知识。
在后世，《本草纲目》不仅为中国药物学的发展作出了重大贡献，而且对世界医药学、植物学、动物学、矿物学、化学的发展也产生了深远的影响。《本草纲目》先后被译成日、法、德、英、拉丁、俄、朝鲜等十余种文字在国外出版。
书中首创了按药物自然属性逐级分类的纲目体系，这种分类方法是现代生物分类学的重要方法之一，比现代植物分类学创始人林奈的《自然系统》早了一个半世纪，被誉为“东方医药巨典”。2011年5月，金陵版《本草纲目》入选世界记忆名录。
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而李时珍的医术范畴很是广泛，其对药物，药方的理解程度，完全可以从《本草纲目》当中看出，而关于李时珍其他的医术，则是可以从其脉学方面的著作可以看出：
李时珍感其时代的中医脉学存有缺憾甚至谬误繁多，便依其父李月池所著《四诊发明》及历史上其他多家脉论精华，于1564年（明嘉靖四十三年）编著成《脉诀》，即《濒湖脉学》。
《濒湖脉学》为李时珍晚年所著，以号命书，是为“濒湖脉学”。《濒湖脉学》语言简明，论脉清澈，不但把临床复杂脉象总结归纳成基本的27种脉象，而且还把主要内容，即脉象、相类脉鉴别、脉象主病，皆以韵文歌括形式撰述，便宜诵记，因此上其书流传深广，历来受医家推崇。
后世认为，《濒湖脉学》对中医基础理论研究和临床实践具有重大的指导意义，为中医典范之作。
而李时珍的典故也不少，其中较为著名的有以下几则：
救活“死人”：
一天，李时珍和大徒弟王广和来到湖口，见一群人正抬着棺材送葬，而棺材里直往外流血。李时珍上前一看，见流出的血不是淤血而是鲜血，于是赶忙拦住人群，让抬棺材的人停下来，众人听了，面面相觑，不敢相信。李时珍看出了大家的心思，反复劝说，终于使主人答应开棺。先是进行了一番按摩，然后又在其心窝处扎了一针，不一会儿，就见棺内的妇人轻轻哼了一声，醒了。不久之后，这名妇女又顺利产下一个儿子，原来这名妇女是因难产而陷入假死。
（这个典故貌似不是李时珍首创，以前看书籍的时候，好像跟孙思邈也有关系。）
活人断症其生死：
一天，有家药店老板的儿子大吃大喝后，纵身翻越柜台，请李时珍诊脉，李时珍告诉他，小兄弟，你活不了三个时辰了，请赶快回家去。众人都不信，那个药店老板的儿子更是大骂不止。果不其然，不到三个时辰，这个人便死掉了。原来是此人吃饭过饱，纵身一跳，肠子断了，内脏受损。
为一味草药专程考察：
有人说，北方有一种药物，名叫曼陀罗花，吃了以后会使人手舞足蹈，严重的还会麻醉。李时珍为了寻找曼陀罗花，离开了家乡，来到北方。终于发现了独茎直上高有四、五尺，叶像茄子叶，花像牵牛花，早开夜合的曼陀罗花，为了掌握曼陀罗花的性能，亲自尝试，并记下了“割疮灸火，宜先服此，则不觉苦也”。证实了单独使用大豆是不可能起解毒作用的，如果再加上一味甘草，就有良好的效果。
善于对对子：
李时珍自幼聪颖善对，还